手术室的清洁主要分为两部分：手术设备和净化设备。这些设备都要用湿布擦拭，不宜使用掉纤维的织物材料，以免纤维漂浮到空气中。由于手术过程中有产生一定的细菌，因此对设备的清洁要使用消毒液，杀灭依附在设备上的细菌。
一般来说，是先实施医用净化工程，建设净化车间，而后安装医疗设备，各种仪器设备在进入手术间前，应组装完毕，擦拭干净。每天应在手术前、后，用消毒液各擦拭1次无影灯、器械车、麻醉桌、手术床、壁柜等各种器材表面及地面。现在医疗资源紧张，做手术往往要排队，洁净手术室也是满负荷运行，一个手术室一天内有几台手术，因此清洁工作也比较繁重。
过滤器是净化手术室的主要净化设备，尤其是高效过滤器，是空气进入室内的最后一道屏障，医用净化工程不可或缺。每半个月，须对粗过滤器、中效过滤器、回风口装置清洗1次，用500mg/L含氯消毒剂(高效)湿拭，以确保尘埃过滤效果，能达到无菌切口感染率小于或等于0.2%的效果。
待清洁工作完成后，虽然已经没有手术要做了，但手术室净化空调系统应继续运行15～20min，再关闭空调，使室内空气达到洁净。这主要是为了避免细菌太多，一夜之间又繁殖了许多，增加了第二天手术净化的难度。在手术前1小时将净化设备打开维持低速运行状态，手术前30～40分钟调至高速运行。
除此之外，每月要厉行对手术室空气、器材表面进行采样做细菌培养，确保洁净度在控制范围内，另外也可看出净化设备运行是否正常，效率如何，是否需要更换设备。。